1、仪器与试药
日立L-2130高效液相色谱仪；日立L-2420紫外检测器；大连依利特Echrom型色谱工作站；岛津2401紫外分光光度计；超声波清洗器SK252H型(上海产)；分析天平(上海良平精密仪器有限公司,Max100 g,D=0.000 1 g)。 华蟾酥毒基(批号110803-200504)和脂蟾毒配基(批号110718-200507)对照品购自中国药品生物制品检定所,供含量测定用。乙腈、甲醇(天津四友)为色谱纯,其他试剂均为分析纯。水为重蒸水。
2、溶液的配制
2.1 供试品溶液的配制
取重量差异项下的本品,研细,约1.5 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率59 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得。
2.2 阴性样品溶液的制备
取缺蟾酥阴性样品,按“2.1”项下方法操作,即得。
2.3 对照品溶液的制备
取华蟾酥毒基对照品15.94 mg,精密称定,取脂蟾毒配基对照品18 mg,精密称定,分别置25 mL量瓶中,用甲醇溶解(必要时超声)并稀释至刻度,摇匀,分别精密量取各1 mL,分别置10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液(每1 mL含华蟾酥毒基63.75 μg、脂蟾毒配基72.00 μg)。
3、色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：乙腈-水(43.5∶56.5)为流动相；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；检测波长为296 nm；进样量：20 μL。理论板数按华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰计算不低于2 700。色谱图见图1。
4、方法学验证
4.1 线性关系
取华蟾酥毒基和脂蟾毒配基对照品,精密称定,用甲醇稀释制成华蟾酥毒基为5.31、10.63、21.25、42.50、63.75 μg/mL和脂蟾毒配基为6.00、12.00、24.00、48.00、72.00 μg/mL的系列。取上述溶液20 μL,注入液相色谱仪,测定。结果华蟾酥毒基线性方程为Y=21.57X+10.15,相关系数r=0.999 8；脂蟾毒配基线性方程为Y=18.79X-10.56,相关系数r=0.999 7。结果表明,华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品分别在5.31～63.75 μg/mL、6.00～72.00 μg/mL范围内与峰面积积分值呈现良好线性关系。
4.2 精密度试验
取同一供试品,分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液。精密吸取20 μL,注入液相色谱仪,依法连续进样6次。结果华蟾酥毒基RSD=2.89%,脂蟾毒配基RSD=1.50%；表明精密度良好。取同一供试品溶液,在0、2、4、6、8、10、24 h不同时间内,分别精密吸取20 μL,注入液相色谱仪,进行测定。结果华蟾酥毒基RSD=2.89%,脂蟾毒配基RSD=2.40%；表明供试品溶液在24 h内基本稳定。精密称取本品约1.5 g,共6份,分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液,于上述色谱条件下连续测定,分别计算华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量(n=6),RSD分别为2.38%和2.96%。精密称取同一供试品,共6份,分别精密加入华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品,分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液,于上述色谱条件下连续测定,计算各样品中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量,并计算回收率。结果见表1。表1 华蟾酥毒基、脂蟾毒配基回收率实验结果 （略）
4.3 样品含量测定
取本品各批约1.5 g,精密称定,分别按“2.1”项下同法操作制备供试品溶液,于上述色谱条件下连续测定,计算各样品中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量。本品为中药复方制剂,组分复杂,经实验发现,样品的提取及前处理对华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定及各组分的.分离影响较大,故对样品的提取及前处理条件进行了筛选。为确定用何种溶剂提取、溶剂的用量、超声处理的时间,我们参考2005年版《中国药典》(一部)梅花点舌丸、麝香保心丸及蟾酥药材等项下的含量测定方法[1],采用正交设计方法安排实验。实验结果表明,提取液用甲醇,溶液剂量25 mL,超声处理30 min,可得到满意的结果。
